INFO

Vayamos al principio, Wuhan, el Gobierno Chino después del problema de patentes con Huawei vs Android y eeuu pone en acción un nuevo software junto con 10mil antenas 5G en la ciudad para iniciar las pruebas de esta tecnología. Cientos de ciudadanos mueren por convulsiones desplomándose en media calle a causa de la alta frecuencia de pulso electromagnético, el 5G sale mal, habrá que rebajar un poco la frecuencia, y para enmascarar el error liberan una cepa de Sars Cov-2 en el aire y agua potable contagiando y declarando la cuarentena en Wuhan. Cierran la ciudad y cualquier vía de información no gubernamental es silenciada. Los blogueros chinos que estaban denunciando estas anomalías desparecieron del mapa. China lo tenía todo planeada.

¿De verdad alguien cree que China construyó un hospital en 10 días?, la única forma posible de construir un hospital en 10 días, es tener aprobado dicho proyecto arquitectónico varios meses atrás, tener el dinero y contratos firmados con la constructora ya listo sobre la mesa, tener el operativo logístico de personal y material preparado con unos tres meses previos, tener estudiado el suelo donde se va a edificar con muchos meses de antelación, con lo cual la única forma de construirlo en 10 días es tener todo el papeleo listo muchos meses atrás.

Debido a la parálisis de la actividad comercial las empresas importantes del país entran en recesión caen en bolsa y son absorbidas por el gobierno Chino, con las empresas extranjeras sucede igual, sus acciones se devalúan hasta límites récords y el gobierno Chino ordena comprarlas tomando el control total, los chinos ganan la partida de ajedrez bursátil a los tiburones de Wall Street y europeos.

Occidente debe contraatacar y utiliza el mismo patrón, el virus Sars-2 o neumonía de Wuhan cruza fronteras y se activa el protocolo de alarma, manipulan las estadísticas de muertes e infectados, siembran miedo entre la sociedad con el objetivo de que acepten un nuevo orden. Europa y América necesitan devolver el golpe a China y esto solo se puede conseguir quebrando todas las economías occidentales para reiniciar un nuevo gobierno unificado, con una moneda más fuerte respaldada por una confederación de países.

El mundo se dividirá en dos bandos, China Rusia Irán, contra Europa y América salvo algunas excepciones, implantarán un orden tecnócrata con una moneda virtual a través de chips y vacunas obligatorias, todos tendremos una identidad virtual única a través de nuestro código biométrico facial o dactilar, ¿te suena? ...Una marca en la cara o en la mano derecha, se trata de que nuestro rostro y huellas dactilares serán nuestra forma de identidad en la red, se llama proyecto “ID2020” conectados a un servidor donde constará toda nuestra información vital.

Jaque Mate Humanidad.

HALLELUYAH

El Eterno dijo estoy probando a mi pueblo para ver quien me es fiel.

Diferencia en el uso del receptor entre el cor0na-v1rus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el co-ro-na-v1rus de murciélago similar al SARS

Diferencia en el uso del receptor entre el cor0na-v1rus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el cor0na-v1rus de murciélago similar al SARS.

https://jvi.asm.org/content/82/4/1899

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RESUMEN

El síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) es causado por el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), que utiliza la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) como su receptor para la entrada celular. Se ha identificado un grupo de CoV similares al SARS (SL-CoV) en murciélagos de herradura. SL-CoVs y SARS-CoVs comparten organizaciones genómicas idénticas e identidades de secuencia altas, con la principal excepción del extremo N terminal de la proteína espiga (S), que se sabe que es responsable de la unión del receptor en CoVs. En este estudio, investigamos el uso del receptor del SL-CoV S combinando un sistema de pseudovirus basado en el virus de inmunodeficiencia humana con líneas celulares que expresan las moléculas ACE2 de murciélago humano, de civeta o de herradura. Además del S de longitud completa de SL-CoV y SARS-CoV, se construyó una serie de quimeras S insertando diferentes secuencias del SARS-CoV S en el esqueleto del SL-CoV S. Se hicieron varias observaciones importantes de este estudio. Primero, el SL-CoV S no pudo utilizar ninguna de las tres moléculas de ACE2 como receptor. En segundo lugar, el SARS-CoV S no pudo ingresar a las células que expresan el murciélago ACE2. Tercero, el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor previamente definido ganó su capacidad de ingresar a las células a través de ACE2 humano, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. Cuarto, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión humana ACE2, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con el SARS-CoV S proteína tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. el SL-CoV S no pudo utilizar ninguna de las tres moléculas de ACE2 como receptor. En segundo lugar, el SARS-CoV S no pudo ingresar a las células que expresan el murciélago ACE2. Tercero, el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor previamente definido ganó su capacidad de ingresar a las células a través de ACE2 humano, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. Cuarto, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión humana ACE2, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con el SARS-CoV S proteína tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. el SL-CoV S no pudo utilizar ninguna de las tres moléculas de ACE2 como receptor. En segundo lugar, el SARS-CoV S no pudo ingresar a las células que expresan el murciélago ACE2. Tercero, el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor previamente definido ganó su capacidad de ingresar a las células a través de ACE2 humano, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. Cuarto, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión humana ACE2, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con el SARS-CoV S proteína tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor previamente definido ganó su capacidad de ingresar a las células a través de ACE2 humano, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. Cuarto, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión humana ACE2, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con el SARS-CoV S proteína tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor previamente definido ganó su capacidad de ingresar a las células a través de ACE2 humano, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. Cuarto, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión humana ACE2, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con el SARS-CoV S proteína tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) es suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión del ACE2 humano, lo que indica que el SL-CoV S es ampliamente compatible con la proteína SARS-CoV S en estructura y en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped. se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) es suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión no ACE2 a la unión del ACE2 humano, lo que indica que el SL-CoV S es ampliamente compatible con la proteína SARS-CoV S en estructura y en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de huésped.

Los brotes del síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) en 2002-2003, que causaron más de 8,000 infecciones y cerca de 800 muertes, fueron causados ​​por un nuevo coronavirus (CoV), ahora conocido como CoV asociado al SARS (SARS-CoV) ( 12 , 25 , 33 , 36 ). La asociación del SARS-CoV con los animales se reveló por primera vez mediante el aislamiento y la identificación de virus muy relacionados en varias civetas de palma del Himalaya ( Paguma larvata ) y un perro mapache ( Nyctereutes procyonoides).) en un mercado de animales vivos en Guangdong, China. Existe una identidad de secuencia genómica muy alta (más del 99%) entre el virus similar al SARS-CoV de las civetas y el SARS-CoV de los humanos, lo que respalda la noción de que el SARS-CoV es de origen animal ( 18 ). Sin embargo, estudios posteriores mostraron que las civetas de palma en granjas y en el campo estaban en gran parte libres de infección por SARS-CoV ( 23 , 40 ). Estos resultados sugirieron que las civetas de palma desempeñaron un papel como huésped intermedio en lugar de como reservorio natural. Los estudios de vigilancia posteriores entre diferentes poblaciones de murciélagos revelaron la presencia en varias especies de murciélagos herradura (género Rhinolophus) de un grupo diverso de CoV, que son muy similares al SARS-CoV en la organización y secuencia del genoma. Estos virus se designan como CoV de tipo SARS (Co-SL) o virus de tipo SARS-CoV ( 26 , 29 ). Tales descubrimientos plantearon la posibilidad de que los murciélagos sean los reservorios naturales del SARS-CoV ( 26 , 29 , 38 ) y desencadenaron un aumento en la búsqueda de CoV en diferentes especies de murciélagos en diferentes ubicaciones geográficas ( 39 , 43 , 44a ).

El análisis filogenético basado en diferentes secuencias de proteínas sugirió que los SL-CoV encontrados en murciélagos y SARS-CoV de humanos y civetas deben colocarse en un subgrupo separado (grupo b) en el grupo 2 de CoV (G2b) para diferenciarlos de otros CoV del grupo 2 en el género Coronavirus ( 17 , 26 , 29 , 43 ). Los CoV G2b muestran diferencias importantes de secuencia en las regiones N-terminales de sus proteínas S. Las proteínas S de los CoV juegan un papel clave en la entrada del virus en las células huésped, incluida la unión a los receptores de la célula huésped y la fusión de la membrana ( 4 , 10 , 24) La enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) se ha identificado como el receptor funcional de SARS-CoV, y la interacción molecular entre ACE2 y la proteína SARS-CoV S se ha caracterizado bien ( 27 , 28 , 31 , 42 ). Se demostró que un fragmento de 193 residuos (aminoácidos [aa] 318 a 510) en la proteína SARS-CoV S es el dominio de unión al receptor mínimo (RBD) que solo pudo unirse de manera eficiente a ACE2 ( 1 , 42a , 45 ) Además, se demostró que cambios menores en los residuos de aminoácidos del motivo de unión al receptor (RBM) de la proteína SARS-CoV S podrían abolir la entrada de SARS-CoV en las células que expresan ACE2 humano (huACE2) ( 7 ,31 ) En la región RBD correspondiente de las proteínas SL-CoV S, existe una divergencia de secuencia significativa de las de las proteínas SARS-CoV S, incluidas dos deleciones de 5 y 12 o 13 aa. A partir del análisis de estructura cristalina del complejo S-ACE2, se predijo que es poco probable que la proteína S de SL-CoV use huACE2 como receptor de entrada ( 30 ), aunque esto nunca se ha probado experimentalmente debido a la falta de SL vivo -CoV aislamientos. También se desconoce si es posible construir una proteína SL-CoV S que se una a ACE2 reemplazando el RBD con el de las proteínas SARS-CoV S.

En este estudio, se empleó un sistema de pseudovirus basado en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) para abordar estos problemas. Nuestros resultados indicaron que la proteína SL-CoV S no puede usar las proteínas ACE2 de diferentes especies para la entrada celular y que la proteína SARS-CoV S tampoco pudo unirse a la molécula ACE2 del murciélago herradura, Rhinolophus pearsonii. Sin embargo, cuando el RBD de SL-CoV S fue reemplazado por el del SARS-CoV S, la proteína S híbrida pudo usar el huACE2 para la entrada celular, lo que implica que las proteínas SL-CoV S son estructural y funcionalmente muy similares a el SARS-CoV S. Estos resultados sugieren que, aunque es poco probable que los SL-CoV descubiertos en los murciélagos infecten a los humanos usando ACE2 como receptor, queda por ver si pueden usar otras moléculas de superficie de ciertos tipos de células humanas para ganar la entrada. También es concebible que estos virus puedan volverse infecciosos para los humanos si experimentan una variación de la secuencia N-terminal, por ejemplo, mediante la recombinación con otros CoV, lo que a su vez podría conducir a una interacción productiva con ACE2 u otras proteínas de superficie en las células humanas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares y anticuerpos. Las líneas celulares humanas 293T y HeLa se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco). El anticuerpo policlonal de cabra contra el ectodominio huACE2 se adquirió de R&D Systems. El anticuerpo monoclonal (MAb) F26G8, que reconoció un epítopo lineal (aa 615 a 620 de la proteína S SARS-CoV) conservado en todas las proteínas S conocidas de SARS-CoV y SL-CoV (M. Yu, resultados no publicados), fue amable proporcionado por Jody Berry ( 3 ). El grupo de VIH del Instituto de Virología de Wuhan generó un MAb contra p24 del VIH (resultados no publicados). Los anticuerpos policlonales de conejo contra ACE2 del murciélago R. pearsonii (RpACE2) se generaron usando una proteína recombinante RpACE2 expresada en Escherichia colien nuestro laboratorio en el Instituto de Virología de Wuhan, siguiendo los procedimientos estándar. Los anticuerpos de inmunoglobulina G de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (AP) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, IgG de cabra anti-conejo conjugada con AP de Chemicon (Australia), mezcla de proteína A / G conjugada con AP de Pierce, e IgG anti-cabra de burro conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de PTGLab (Chicago, IL).

Construcción de plásmidos de expresión. La construcción de un gen de la proteína de la espiga (S) con codón optimizado de SARS-CoV BJ01 (BJ01-S) en pcDNA3.1 (+) se describió anteriormente ( 34 , 46 ). El gen S de longitud completa de un murciélago SL-CoV (Rp3) se clonó mediante amplificación por PCR a partir de ADNc preparado utilizando muestras fecales de un murciélago R. pearsonii positivo para SL-CoV ( 29 ). Después de la optimización del codón para los primeros 400 aa en el extremo N, el gen S modificado se clonó en pcDNA3.1 (+). Para la introducción de la RBM de SARS-CoV S en el SL-CoV S, la región de codificación de aa 424 a 494 de BJ01-S se usó para reemplazar las regiones correspondientes de Rp3-S, dando como resultado un gen quimérico S (CS) designado CS 424-494. Usando la misma estrategia, se construyó una serie de genes CS con secuencias BJ01-S mediante reemplazo gradual. Para facilitar la construcción de quimeras S, se introdujo una mutación puntual (A a G) en el nucleótido 1825 (el residuo A del codón ATG se designó nucleótido 1) para generar un sitio EcoRI único en el marco de lectura abierto S. La quimera CS 424-494 se confirmó por secuenciación completa para garantizar que no se introdujera una mutación inesperada durante los procesos de PCR. Para otras quimeras construidas usando CS 424-494 como plásmido donante, solo las secuencias recién insertadas entre los sitios BamHI (en el extremo 5 ') y EcoRI (en el nucleótido 1825) se confirmaron por secuenciación directa. La numeración de aminoácidos de BJ01-S se utilizó para todas las construcciones quiméricas en este estudio.

Clonación de genes ACE2 y establecimiento de líneas celulares que expresan ACE2. La región de codificación para el homólogo ACE2 en el murciélago de herradura R. pearsonii se obtuvo del intestino de un murciélago infectado con SL-CoV por PCR usando los siguientes cebadores: 5'-C GGATCC GCCACCATGTCAGGCTCTTTCTGGC-3 '(cebador aguas arriba que contiene un sitio BamHI) [subrayado]) y 5'-C GTCGAC CTAAAAGGAGGTCTGAACATCATCA-3 '(cebador aguas abajo con un sitio SalI [subrayado]). Las líneas celulares que expresan las proteínas huACE2 y civeta de palma (pcACE2) se establecieron en un estudio previo ( 37) La región de codificación bat ACE2 se clonó en un vector retroviral, pBabe-pure, y luego se transdujo en células HeLa para generar líneas celulares estables que expresan el bat ACE2 siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente ( 37 ). La expresión estable de ACE2 en las células HeLa transducidas se confirmó mediante ensayos de transferencia Western, inmunofluorescencia y actividad de ACE2.

Construcción y purificación de pseudovirus. Los pseudovirus basados ​​en el VIH se prepararon como se describió anteriormente ( 37 ). En resumen, 12 μg de pHIV-Luc (pNL4.3.Luc.R - E - -Luc) y los plásmidos que expresan S (o control de vector vacío) se cotransfectaron en 2 x 10 6 células 293T en platos de 10 cm. . Después de 8 h, el medio se reemplazó con medio nuevo. Los sobrenadantes se recogieron a las 48 h después de la transfección, se clarificaron a partir de los restos celulares mediante centrifugación a 3.000 × gy se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 μm (Millipore). Los seudovirus en el sobrenadante celular (4 ml) se purificaron por ultracentrifugación a través de un colchón de sacarosa al 20% (4 ml) a 55,000 × gdurante 60 minutos con un rotor Ty90 (Beckman). Los pseudovirus granulados se disolvieron en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenaron a -80 ° C en alícuotas hasta que se utilizaron. Para evaluar la incorporación de proteínas S y p24 de VIH en los virus seudotipados, 20 μl de virus purificados se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencia Western como se detalla a continuación.

Análisis de la expresión de la proteína S y el empaquetamiento de pseudovirus por transferencia Western.Los lisados ​​de células 293T y HeLa o pseudoviriones granulados se separaron por SDS-PAGE (usando geles al 8%), seguido de transferencia a una membrana de nitrocelulosa (Millipore). Para la transferencia Western, la incubación con diferentes anticuerpos se realizó a temperatura ambiente durante 1 h. Para la detección de la expresión de S, la membrana se incubó con MAb F26G8 (1: 1,000), y los anticuerpos unidos se detectaron usando la IgG anti-ratón de cabra conjugada con AP, también diluida a 1: 1,000. Para detectar el VIH p24 en pseudovirus, se usó un MAb contra VIH p24 (p24 MAb) como el primer anticuerpo a una dilución de 1: 1,000, seguido del mismo anticuerpo conjugado con AP descrito anteriormente. La expresión de ACE2 en células HeLa se detectó usando el anticuerpo de cabra contra el ectodominio huACE2 (1: 500) o el anticuerpo de conejo contra el murciélago RpACE2 (1: 100) como anticuerpo primario.

Examen de viriones de pseudovirus por EM. Los pseudovirus purificados se verificaron por microscopía electrónica (EM) utilizando rejillas de cobre recubiertas con carbono y Formvar (malla 200), se tiñeron negativamente con ácido fosfotungástico al 2% (pH 7,0) y se examinaron a 75 kV en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000FA. .

Microscopía confocal de inmunofluorescencia. Las células HeLa que expresan y controlan ACE2 se cultivaron en cubreobjetos en placas de 24 pocillos (Costar, Corning, NY). Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante 30 minutos a 4 ° C, seguido de incubación durante la noche con anticuerpo de cabra anti-huACE2 (a dilución 1: 150 en PBS) a 4 ° C. Al día siguiente, la incubación con IgG anti-cabra de burro conjugada con FITC (a una dilución 1: 100 en PBS) se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para la tinción nuclear, las células se incubaron con Hoechst 33258 durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cada paso de incubación fue seguido por lavado con PBS cinco veces. Después del lavado final, los portaobjetos se montaron con glicerol al 50% y se observaron bajo un microscopio confocal Leica (Leica, Alemania).

Ensayo de actividad de ACE2. La fracción de membrana celular se preparó como se describió anteriormente ( 11 ). En resumen, las células HeLa (con o sin expresión de ACE2) se recogieron por centrifugación a 10.000 × g durante 5 min. El sedimento celular se lavó con PBS helado y se suspendió en solución salina tamponada con Tris (TBS) (Tris 100 mM y NaCl 500 mM, pH 6,5). Las células fueron sometidas a tres ciclos de congelación / descongelación, seguidos de una breve sonicación en hielo. El lisado celular se centrifugó a 15,000 × gdurante 30 min, y el sobrenadante se tomó como la fracción de proteína soluble. El sedimento, que contenía la fracción de membrana, se lavó con TBS helado y se volvió a centrifugar como se describió anteriormente. Después de la resuspensión en TBS, se determinó el contenido total de proteínas tanto de la membrana como de las fracciones solubles con un kit de ensayo de proteínas BCA (Chenergy Biocolor, China) utilizando albúmina de suero bovino como estándar. La actividad del ensayo ACE2 se determinó según lo descrito por Douglas et al. ( 11) utilizando el sustrato fluorescente inactivo específico de ACE2 QFS (7-metoxicumarina-4-il) -acetil-Ala-Pro-Lys (2,4-dinitrofenilo), comprado en Auspep (Melbourne, Australia). Los ensayos se realizaron en placas negras de 96 pocillos con QFS 50 μM por reacción. La fluorescencia liberada (en unidades de fluorescencia relativa) después de la incubación a 37 ° C durante 1 h se midió a 320 a 420 nm. Para demostrar una inhibición específica, la actividad de ACE2 también se determinó en presencia de EDTA 0,1 mM.

Infección por pseudovirus y ensayo de infectividad. Las células HeLa que expresan huACE2, pcACE2 o murciélago RpACE2 se sembraron en una placa de 96 pocillos a 1 × 10 4células / pocillo 1 día antes de la infección. Para la infección, se añadieron a las células 4 μl de pseudovirus purificados mezclados con 96 μl de medio que contenía 8 μg / ml de Polybrene. La mezcla se retiró y se reemplazó con medio nuevo 8 a 12 h después de la infección (pi). La infección se controló midiendo la actividad de luciferasa, expresada a partir del gen informador transportado por el pseudovirus, usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Brevemente, las células se lisaron a las 48 h pi mediante la adición de 20 μl de tampón de lisis proporcionado con el kit, y se analizaron 10 μl de los lisados ​​resultantes para determinar la actividad de luciferasa mediante la adición de 50 μl de sustrato de luciferasa en un Turner Designs TD-20 / 20 luminómetro. Cada experimento de infección se realizó por triplicado, y todos los experimentos se repitieron tres veces.

Número de acceso de GenBank. La secuencia de la región de codificación de R. pearsonii ACE2 se ha depositado en GenBank con el número de acceso EF569964 .